Medición de la intensidad usando ImageJ

tenemos que medir la intensidad de la fluorescencia en ciertas regiones de las imágenes usando imagej. se nos ocurrieron los siguientes pasos para medir la intensidad. si bien parece correcto, mi pregunta es --> ¿realmente estamos midiendo la intensidad correctamente usando los siguientes pasos o estamos midiendo erróneamente otra cosa y creyendo que ese valor es la intensidad?

Haz que la imagen sea de 8 bits.

Umbral de la imagen (Imagen > Ajustar > Umbral) para delinear todas las regiones y haga clic en Aplicar

Abra Analizar > Analizar partículas. Asegúrese de hacer clic en "agregar al administrador"

Analizar > Analizar partículas > Mostrar > Contornos desnudos. Esto abrirá una nueva imagen.

Abra la imagen de microscopía de color. Luego, Imagen > Superposición > Desde el Administrador de ROI.

Imagen > Superposición > Al administrador de ROI.

En el Administrador de ROI: presione "medir". (Aparecerá una ventana de resultados con puntos de datos individuales)

Haga clic derecho en la ventana Resultados y haga clic en Resumir.

Registrar datos de intensidad media

¿estamos midiendo correctamente los datos de intensidad media utilizando los pasos anteriores?

Solución del problema

Hay algunas cosas que debe tener en cuenta al medir la intensidad en imageJ:

ImageJ convierte automáticamente las imágenes a 8 bits

SIEMPRE debe usar RAW si está disponible

Si su microscopio no puede guardar archivos en formato RAW, debe usar.tif, otros formatos crean artefactos

Guarde los canales por separado, no como una pila RGB si está utilizando el formato.tif

Antes del umbral, debe dividir los canales, especialmente si está buscando fluorescencia de una cierta longitud de onda.

También debe usar la función "Cuenca hidrográfica" después del umbral para que delinee las celdas individuales, lo que le permite evitar delinear un grupo de celdas juntas. De esta manera puedes medir sus intensidades individuales. Sin embargo, no es perfecto, por lo que una vez que aparece el ROI y las celdas han sido delineadas por el análisis de partículas, debe pasar y asegurarse de que esté midiendo celdas singulares. Cualquier esquema que contenga más de una celda debe eliminarse. También busque células o micronúcleos con formas extrañas, que también deben eliminarse.

Ahora supongo que estás midiendo células cancerosas humanas. Debes usar estos ajustes:

Después de todo esto, aplica la superposición. Independientemente de la imagen que esté superponiendo, también debe dividir los canales de esa y usar el canal que contiene la longitud de onda que está midiendo (es decir, Alexaflour 488 estaría en el canal GFP).

Si ha estado recopilando datos sin hacer esto, los desecharía todos, ya que el procedimiento realizado para recopilarlos no ha controlado nada.

También en cuanto a dónde ir para preguntar estas cosas.